اندازه گیری قند محلول

اندازه گیری قند محلول

https://khosheparvar.ir/ خوشه پرور

گرداورنده: سید خالد قیصری

استخراج کربوهیدرات محلول در آب

 

 قندهای محلول در غلات شامل ساکارز، فروکتوز، گلوکز، فروکتان و… می باشد.  تقریباً 80 درصد قند محلول در گندم و جو از نوع فروکتان است.

ماده حاصل از فتوسنتز گیاه در کلروپلاست تریوزفسفات (Tp) است که در نهایت در سه مسیر قرار می‌گیرد: تنفس، رشد و نگهداری( ترکیبات ساختاری) و ذخیره در واکوئل به صورت فروکتان.

آنزیم های دخیل در این فرآیندها شامل SPP( ساکارز فسفات فسفاتاز)، SPS( ساکارز فسفات سنتاز)، SS( ساکار سنتاز)، 6-SFT ( sucrose:fructan 6-fructosyltransferase )، 1-SST ( sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase )، 1-FFT ( fructan:fructan 1-fructosyltransferase ) است.

تولیدات فتوسنتزی مازاد بر مصرف گندم به طور عمده در ساقه ذخیره شده تا در مراحل انتهایی رشد صرف پر شدن دانه شود.

ساقه گندم از لحاظ ذخیره سازی به سه قسمت: پدانکل(Pd)، پنالتی میت(Pn) و میانگره های زیرین(Lw) تقسیم می‌شود.

از لحاظ ذخیره کربوهیدرات عموماً  قسمت Lw بیشترین میزان ذخیره را دارد علی رغم اینکه از لحاظ طولی نسبت چندانی از ساقه را تشکیل نمی دهد و دلیل اصلی این مورد عدم رقابت با مخزن دیگر برای کسب مواد است زیرا در این زمان بوته هنوز به گلدهی و گرده افشانی ورود نکرده. کم ترین میزان قند نیز در قسمت Pd است، زیرا همزمان است با مرحله گرده افشانی و پرشدن دانه.

جهت استخراج و اندازه گیری قند محلول از روش Ehdaie  همراه با استفاده از Inoline برای رسم منحنی استاندارد استفاده می‌شود.

ابتدا برای تهیه عصاره، 0.32 گرم نمونه خشک شده  را به قطعات 4-2 میلی متری خرد کرده و همراه با 8 سی سی آب مقطر در فالکون قرار می دهیم.

فالکون ها را با استفاده از رک در بنماری 98 درجه سانتی گراد به مدت 60 دقیقه قرار می دهیم.  سپس نمونه ها در دمای 10 درجه به مدت 10 دقیقه و 7 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ می شود.

بعد از سانتریفوژ از قسمت بالایی نمونه که همان عصاره( سوپرناتانت) است 2 میلی لیتر برداشته و داخل میکروتیوب ریخته می شود.  برای نگهداری می توان نمونه را در یخچال منفی 20 درجه قرار داد.

در مرحله بعد اقدام به ساخت محلول واکنش گر ( رزورسینول) می شود. ساخت محلول با نسبت های  100 سی سی اتانول 98% ، 30 سی سی HCL 37 و 1 گرم رزورسینول انجام می گیرد. برای نگهداری می توان محلول را در یخچال مثبت 4 درجه قرار داد.

نکته: میزان محلول را با توجه به تعداد نمونه می توان با استفاده از نسبت های بالا تغییر داد

نکته: به دلیل وجود  HCL حتما در زمان ساخت محلول از ماسک استفاده شود و کار زیر هود انجام گیرد.

در مرحله بعد 15 میکرو لیتر عصاره  هرکدام از سه قسمت ساقه  را همراه با 650 میکرولیتر محلول واکنشگر در میکروتیوب ریخته و در بنماری بالای 90 درجه سانتیگراد به مدت 8 دقیقه قرار می دهیم. سپس بلافاصله نمونه ها را  8 دقیقه در حمام آب یخ غوطه ور کرده تا واکنش متوقف شود.

نکته: رنگ نمونه ها با توجه به میزان قند موجود ممکن است از صورتی تا قرمز پر رنگ باشد.

سپس میزان 200 میکرولیتر از هر نمونه را در پلیت ریخته و کد سلول و نمونه را یادداشت می کنیم. مکونه به وسیله پلیت ریدر در طول موج 520 نانومتر قرائت می گردد.

در مرحله بعد برای ایجاد نمودار استاندارد  نیاز به تهیه استوک است، به این منظور از 0.05 گرم اینولین 1 سی سی آب مقطر استفاده شده و محلول را به وسیله دستگاه ورتکس یکدست و بدون رسوب می نماییم.

بعد از آن اقدام به ساخت 12 تیمار استوک با غلظت های متفاوت می شود:

150	130	110	90	70	50	35	25	15	10	5	0	استوکlµ
350	370	390	410	430	450	465	475	485	490	495	500	آب مقطرlµ

همانند مرحله قبل این نمونه ها را نیز در پلیت ریخته و با استفاده از پلیت ریدر در طول موج 520 نانومتر قرائت می شود.

در آخر با قرار دادن دیتاهای به دست آمده از استوک و به وسیله نرم افزار اکسل  نمودار رسم نموده و رگرسیون خط را به دست می‌آوریم، سپس عدد به دست آمده از قرائت نمونه های گیاهی را به جای X در فرمول قرار داده و میزان قند محلول را حساب می کنیم.

Y = ax ⁺_– b

اندازه گیری قند محلول