اندازه گیری کلروفیل

روش های اندازه گیری کلروفیل

https://khosheparvar.ir/ خوشه پرور

دستگاه SPAD، روش آرنون و روش متانول خالص

مشاوره و انجام آزمایش: 09302585607

گرداورنده: سید خالد قیصری

کلروفیل جزو رنگدانه های گیاهی است که در فتوسنتز اهمیت بالایی دارد. برای اندازه گیری کلروفیل گیاهان روش‌های مختلفی ارائه شده است که اکثرا بر اندازه گیری جذب نور در طول موج‌های مشخص استوار است.

استفاده ازکلروفیل متر ( SPAD ) :

 دستگاهی قابل حمل بوده که قابلیت اندازه گیری کلروفیل برگ را بدون نیاز به قطع کردن برگ از گیاه را در مدت زمان کوتاه فراهم می‌کند.

استفاده از این دستگاه بسیار ساده بوده و با سرعت بالایی می‌توان با سنجش میزان نسبی کلروفیل به سنجش وضعیت گیاه پرداخت.

برای شروع کار باید دستگاه کالیبره شود، بدین منظور پس از روشن کردن به وسیله دکمه/اهرم (ON/OFF) با فشار دادن دادن اهرم بالایی و مکث کوتاه دستگاه ب صورت خودکار کالیبره و آماده استفاده می باشد

در مرحله بعد اقدام به نمونه گیری می کنیم، برای این کار  اقدام به نمونه گیری از پنج نقطه برگ کرده و پس از هر تست با استفاده از کلید میانگین (AVERAGE) میزان نسبی کلروفیل رل ثبت کرده و پس از اتمام کار میانگینی از تعداد نقاط نمونه برداری را خواهیم داشت که بیانگر میزان کلروفیل نسبی نمونه می باشد

با استفاده از نمونه گیری های متعدد و در فاصله های مشخص زمانی اقدام به رسم نمودار و سنجش اطلاعات به دست آمده  جهت دست یابی به اهداف آزمایشی می شود

نکته: در زمان نمونه برداری از قرار گرفتن صحیح نمونه بر روی حسگر دستگاه اطمینان حاصل شود

روش آرنون (Arnon) :

 1 – مقدار نیم گرم از ماده تر گیاهی را در هاون چینی ریخته، سپس با استفاده از نیتروژن مایع آن را خرد کرده و به خوبی پودر نمایید.

2- ۲۰ ميلي لیتر استن 80٪ به نمونه اضافه، سپس در دستگاه سانتریفیوژ با سرعت6000 دور در دقیقه به ­مدت 10 دقیقه قرار دهید. عصاره جدا شده فوقانی حاصل از سانتریفیوژ را به وسیله سمپلر به پلیت منتقل کنید.

3- مقداری از نمونه داخل پلیت ریخته و سپس به طور جداگانه در طول موج های 663، ۶۴۵ و 470 نانومتر توسط پلیت ریدر مقدار جذب را قرائت نمایید.

4- در نهایت با استفاده از فرمول­های زیر میزان کلروفیل a ، b و کاروتنوئیدها بر حسب میلی گرم بر گرم وزن تر نمونه به­  دست می آید.

Chlorophyll a = (19.3 _* A663) – (0.86 _* A645) V/100W

Chlorophyll b = (19.3 _* A645) – (3.6 _* A663) V/100W

Carotenoides = 100(A470) – 3.27(mg chl. a) – 104(mg chl. b)/227

V= حجم محلول صاف شده (محلول فوقانی حاصل از سانتریفیوژ)

A= جذب نور در طول موج­های 663، 645 و 470 نانومتر

W= وزن تر نمونه بر حسب گرم

روش متانول خالص:

در این روش پس از برداشت نمونه از گیاه بلافاصله در فویل آلومینیومی قرار داده و به مخزن ازت مایع انتقال می‌دهیم. سپس در آزمایشگاه نمونه را داخل هاون چینی ریخته و به وسیله ازت مایع پودر می‌کنیم.

نکته مهم در این مرحله حفظ دمای پایین نمونه است تا دچار پس آبیدگی و تجزیه نشود.

پس از این مرحله مقدار مشخص نمونه (0.2 گرم) را با 4 میلی لیتر متانول خالص در ظرف مناسب( ترجیحا فالکون 15) ریخته و به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و در تاریکی قرار می‌دهیم.

پس از نیم ساعت نمونه را به سانتریفیوژ منتقل کرده و به مدت 10 دقیقه روی 12 الی 14 هزار دور در دقیقه و دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار می‌دهیم.

نکته مهم در این مرحله: فالکون باید در سانتریفیوژ هم سایز قرار بگیرد و همچنین نمونه ها به صورت رو به رو هم وزن  باشند تا از مشکلات بعدی مانند خارج شدن از محور و… در زمان چرخش خو داری گردد

بعد از اتمام مرحله قبل نمونه به صورت دو فاز در لوله فالکن قرار می‌گیرد، بخش پایینی رسوب و بقایای نمونه و قسمت بالا عصاره (سوپرناتانت).

جهت نمونه برداری از عصاره به میزان 200 میکرولیتر به وسیله سمپلر برداشت می شود و در پلیت قرار می گیرد.

نکته: برای جلوگیری از تکان خوردن و بالا آمدن رسوب و همچنین ریخته شدن نمونه فالکون ها را در رک (پایه) مخصوص قرار دهید.

پلیت اکثرا به صورت 96 خانه بوده و هر خانه با یک عدد و یک حرف کدگذاری شده است، زمانی که تعداد نمونه به دلیل تیمار، تکرار و عوامل دیگر بالا باشد این کدگذاری روش مناسبی برای تفکیک نمونه‌ها می‌باشد.

در مرحله آخر پلیت را در دستگاه پلیت ریدر قرار داده و در سه طول موج 666، 653 و 470 نانومتر قرائت می‌گردد، در نهایت اعداد به دست آمده در معادله های زیر برای به دست آوردن میزان کلروفیل a، b و کارتنوئید جای‌گذاری می‌شود.

نکته: قبل از استفاده از پلیت، از تمیز و شفاف بودن آن اطمینان حاصل شود تا در زمان قرائت با خطا مواجه نشوید.

ظروف مورد استفاده را بعد از اتمام کار با آب مقط و محلول  4 % SDS تمیز کنید.

Chlorophyll a = (15.65 * A666) – (7.34 * A653)

Chlorophyll b = (27.05 * A653) – (11.21 * A666)

Carotenoides = ((1000 * A470) – (2.86 * Chll a) – (129.2 * Chll b)) / 245